我院陳皓鋆團隊近期發(fā)表于《Journal of Nuclear Medicine》（IF=11.1,，JCR Q1）的基礎(chǔ)研究，題目為“Development of FAPI Tetramers to Improve Tumor Uptake and Efficacy of FAPI Radioligand Therapy”（DOI: https://doi.org/10.2967/jnumed.123.265599）,。在這篇文章中,，作者構(gòu)建了一種靶向FAP的新型四聚體放射性探針DOTA-4P(FAPI)4，并評價其在FAP表達陽性荷瘤鼠模型中的生物分布,，68Ga/64Cu PET顯像,，及177Lu放射靶向治療效果。實驗結(jié)果顯示,，在多結(jié)合位點效應(yīng)的作用下,，FAPI的四聚體與FAP具有更高的結(jié)合能力，有望將來應(yīng)用于FAP陽性表達實體瘤的放射靶向治療,。
本文的通訊作者為廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科及閩南PET中心的陳皓鋆教授,，廈門大學(xué)郭志德教授。廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院博士生逄一臻,、趙亮,，廈門大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院博士生方建陽為本文共同第一作者。
原文鏈接：https://jnm.snmjournals.org/content/early/2023/06/15/jnumed.123.265599
研究背景介紹
腫瘤相關(guān)成纖維細胞（CAF）是多種上皮性腫瘤間質(zhì)的重要組成部分,，在腫瘤生長,、免疫抑制和腫瘤侵襲中發(fā)揮重要作用。成纖維細胞激活蛋白（fibroblast activation protein,，FAP）為Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶,，其高表達于多種上皮性腫瘤相關(guān)成纖維細胞中，而在正常組織,、良性腫瘤間質(zhì)中無表達或表達較低,。因此，以FAP為靶點的分子探針（FAP抑制劑,，FAPI）是一種有前景新型成像和治療技術(shù),，可應(yīng)用于多種惡性腫瘤的PET顯像及靶向治療中。
一些基于喹啉的FAP抑制劑(FAPI)已經(jīng)被開發(fā)進行PET顯像和靶向治療,。68Ga-FAPI-46似乎是該系列中最有希望的衍生物,，具有較高的腫瘤/本底比和較高的腫瘤攝取。然而,，其相對較短的腫瘤滯留時間可能限制了其在惡性腫瘤靶向治療中的應(yīng)用,。
研究設(shè)計思路
在筆者團隊的前期研究中,，利用多價效應(yīng)和添加兩親性聚乙二醇連接體（PEG修飾）的方法成功設(shè)計并合成了一種新型的FAPI二聚體（DOTA-2P(FAPI)2）。臨床前和臨床PET研究表明,，68Ga-DOTA-2P(FAPI)2比68Ga-FAPI-46具有更高的腫瘤攝取和更長的腫瘤滯留時間,。其他FAPI二聚體，包括DOTAGA,、(SA.FAPi)2和BiOncoFAP也獲得了類似的結(jié)果,。因此，多價效應(yīng)可能是開發(fā)FAP靶向放射性藥物的有效策略,。此外,，如果能進一步提高腫瘤滯留時間和攝取，靶向FAP的放射配體治療可能更有效,。
在這篇文章中,，作者團隊基于FAPI-46基礎(chǔ)構(gòu)建FAPI四聚體，在4個FAPI活性基團之間各加入4個微型聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)(PEG3)間隔,，以DOTA作為螯合劑用于放射性核素68Ga和177Lu的標記（前體表示為DOTA-4P(FAPI)4）并用于PET顯像及放射性配體治療實驗,；以NOTA作為螯合劑用于放射性核素64Cu的標記（前體表示為NOTA-4P(FAPI)4）并用于PET顯像（圖1）。本研究旨在探討FAPI四聚體在體外和體內(nèi)的腫瘤靶向潛力,，并評估這種形式是否比其單體和二聚體類似物更有效,。
圖1. FAPI四聚體DOTA-4P(FAPI)4的化學(xué)結(jié)構(gòu)
實驗結(jié)果介紹
作者團隊成功合成FAPI四聚體并進行放射性標記。68Ga-DOTA-4P(FAPI)4和177Lu-DOTA-4P(FAPI)4標記產(chǎn)率均>90%,，放化純均大于95%,；68Ga與177Lu標記的四聚體與血清常溫下共溫育4小時及24小時后未觀察到顯著的脫金屬和游離放射性，表明其具有高度穩(wěn)定性,。利用HT-1080-FAP細胞進行FAPI-46、DOTA-2P(FAPI)2和DOTA-4P(FAPI)4的細胞攝取阻斷實驗和細胞競爭結(jié)合實驗,。細胞攝取阻斷實驗提示68Ga-DOTA-4P(FAPI)4的攝取值顯著高于68Ga-DOTA-2P(FAPI)2和68Ga-FAPI-46 (120 min時57.98±0.27% vs. 32.40±5.36% vs. 22.93±0.33%),；加入FAPI-46前體后可以顯著阻斷68Ga-DOTA-4P(FAPI)4和FAP之間的結(jié)合，證實了FAPI四聚體靶向FAP的特異性（圖2）,。細胞競爭結(jié)合實驗中,，通過加入不同濃度FAPI-46前體，擬合得到68Ga-FAPI-46,、68Ga-DOTA-2P(FAPI)2和68Ga-DOTA-4P(FAPI)4的IC50值分別為11.38 nM,、17.04nM和15.56nM（圖2）。三者的IC50相當,，表明FAPI結(jié)構(gòu)的四聚體在體外對受體親和力影響較小,。
圖2. 68Ga標記FAPI單體,、二聚體和四聚體體外細胞結(jié)合實驗
在證明四聚體探針在HT-1080-FAP細胞中具有更高的腫瘤攝取后,，為進一步評價68Ga-DOTA-4P(FAPI)4的體內(nèi)藥代動力學(xué)特征，對HT-1080-FAP荷瘤鼠模型進行60 min動態(tài)PET掃描（圖3）,。如圖3A所示，68Ga-DOTA-4P(FAPI)4在腫瘤中的攝取非常迅速,，呈持續(xù)上升趨勢,；而68Ga-DOTA-4P(FAPI)4在心臟、腎臟和肝臟中的攝取隨時間逐漸降低,。在對HT-1080-FAP荷瘤鼠模型進行不同時間點靜態(tài)PET掃描中,，PET顯像結(jié)果示68Ga-DOTA-4P(FAPI)4和68Ga-DOTA-2P(FAPI)2在腫瘤中一直保持較高的顯像劑濃聚,，正常臟器中攝取較低,，圖像具有良好的靶/本底比(圖3B-C)。在與相同劑量和比活度的68Ga-FAPI-46對比實驗中,，3種探針的體內(nèi)分布特征相似(圖3D),。PET半定量結(jié)果示，68Ga-DOTA-4P(FAPI)4,、68Ga-DOTA-2P(FAPI)2和68Ga-FAPI-46的腫瘤攝取在注射后1 h差異無統(tǒng)計學(xué)意義,，但注射后4 h腫瘤對68Ga-DOTA-4P(FAPI)4的攝取明顯高于68Ga-DOTA-2P(FAPI)2［SUVmean, 1.99 ± 0.09 vs. 1.71 ± 0.10, P=0.018］和68Ga-FAPI-46［SUVmean, 1.99 ± 0.09 vs. 1.20 ± 0.07, P < 0.001］。
圖3. 68Ga標記FAPI單體,、二聚體和四聚體在HT-1080-FAP荷瘤鼠模型的PET顯像及定量研究
在U87MG（人膠質(zhì)母細胞瘤,，腫瘤細胞中FAP陽性表達）荷瘤鼠模型中，三種放射性示蹤劑的腫瘤攝取差異更為顯著,。如圖4所示,，U87MG腫瘤中68Ga-DOTA-4P(FAPI)4攝取(1 h p.i)約為68Ga-DOTA-2P(FAPI)2攝取的2倍(SUVmean, 0.72±0.02 vs. 0.42±0.03, P<0.001)，較68Ga-FAPI-46攝取高4倍以上(SUVmean, 0.72±0.02 vs. 0.16±0.01, P<0.001),。此外,，在注射后1H-4H期間，U87MG腫瘤中68Ga-DOTA-4P(FAPI)4和68Ga-DOTA-2P(FAPI)2的攝取基本穩(wěn)定,，而68Ga-FAPI-46在腫瘤中攝取隨時間顯著降低,。
圖4. 68Ga標記FAPI單體、二聚體和四聚體在U87MG荷瘤鼠模型的PET顯像及半定量數(shù)據(jù)
為驗證該四聚體探針與FAP結(jié)合的特異性,，進行體內(nèi)阻斷實驗評估,。結(jié)果顯示，用未標記的“冷前體”FAPI-46進行阻斷后,，在大多數(shù)器官中檢測到68Ga-DOTA-4P(FAPI)4放射性的顯著下降（圖5）,，而腫瘤攝取的下降幅度最為顯著（未阻斷的SUVmean, 1.87±0.08 vs.阻斷的SUVmean, 0.16±0.03;腫瘤攝取減少92%）,。
圖5. 68Ga標記FAPI四聚體在HT-1080-FAP荷瘤鼠模型中顯像及阻斷顯像
為觀察放射性藥物在體內(nèi)的分布，以及在腫瘤病灶中的攝取和洗脫過程,，使用半衰期較長的放射性核素(64Cu, t1/2 = 12.7 h)標記FAPI四聚體和二聚體,，進行多時間點PET顯像研究。實驗結(jié)果顯示,，在所有掃描時間點內(nèi)HT-1080-FAP腫瘤對64Cu-NOTA-4P(FAPI)4的攝取始終高于64Cu-NOTA-2P(FAPI)2,而64Cu-NOTA-4P(FAPI)4在腫瘤中的洗脫速度低于64Cu-NOTA-2P(FAPI)2 (圖6),。在腎臟、肝臟中64Cu-NOTA-4P(FAPI)4的攝取亦高于64Cu-NOTA-2P(FAPI)2,，而在其他非靶器官中的示蹤劑攝取,，兩者基本相似。
圖6. 64Cu標記FAPI四聚體及二聚體在HT-1080-FAP荷瘤鼠模型中的PET顯像
為了進一步評價該四聚體FAPI探針作為放射性治療藥物的可行性,，利用診療一體化核素177Lu進行四聚體探針的放射性標記,，并進行多時間點SPECT顯像，探索177Lu-DOTA-4P(FAPI)4在腫瘤中的攝取及體內(nèi)的分布特征,。FAPI四聚體,、二聚體和單體FAPI-46的代表性SPECT圖像如圖7所示。與64Cu-PET顯像結(jié)果相似,，177Lu-DOTA-4P(FAPI)4在HT-1080-FAP荷瘤鼠中的腫瘤攝取在各時間點均顯著高于二聚體177Lu-DOTA-4P(FAPI)4和單體FAPI-46(圖7),。生物分布實驗的定量結(jié)果（圖8）顯示：177Lu-DOTA-4P(FAPI)4在注射后24 h的腫瘤攝取為21.1.4±1.7% ID/g，腫瘤清除相對緩慢 (48h,、72h,、96h分別為19.2±0.6% ID/g, 18.8±2.1% ID/g和14.8±0.9% ID/g)。二聚體177Lu-DOTA-2P(FAPI)2在注射后24 h的腫瘤攝取為17.1±3.9% ID/g,，略低于四聚體177Lu-DOTA-4P(FAPI)4,，但FAPI二聚體在腫瘤中的洗脫速度較FAPI四聚體更快，在48,、72和96 h時的攝取值分別為18.8±4.1% ID/g,、13.8±2.6% ID/g和13.1±0.7% ID/g。單體177Lu-FAPI-46經(jīng)尾靜脈注射后24 h的腫瘤攝取顯著低于177Lu-DOTA-4P(FAPI)4 (3.4±0.7% ID/g, P<0.001),。
圖7. 177Lu標記FAPI四聚體,、二聚體和單體在HT-1080-FAP荷瘤鼠模型的SPECT顯像
圖8. 177Lu標記FAPI四聚體、二聚體和單體在HT-1080-FAP荷瘤鼠模型中的生物分布實驗
在完成體內(nèi)核素顯像評估后,，作者分別在HT-1080-FAP和U87MG兩種荷瘤鼠模型中進行177Lu 放射靶向治療實驗（Radioligand therapy,，圖9）。核素治療實驗結(jié)果顯示,，在HT-1080-FAP（圖9A）及U87MG兩種荷瘤鼠模型中（圖9B）,，177Lu-DOTA-4P(FAPI)4的治療效果明顯優(yōu)于177Lu-FAPI-46和177Lu-DOTA-2P(FAPI)2。
圖8. 177Lu標記FAPI四聚體、二聚體和單體在HT-1080-FAP荷瘤鼠模型和U87MG荷瘤鼠模型的放射性配體治療實驗
總結(jié)
本研究中,，作者針對成纖維細胞激活蛋白（FAP）靶向分子腫瘤攝取和滯留的改構(gòu)優(yōu)化問題,，利用多價效應(yīng)成功構(gòu)建了基于FAPI的四聚體放射性探針，通過一系列的臨床前研究評價了其在體外與FAP的親和力,、體內(nèi)藥代動力學(xué)特性,，及在荷瘤鼠模型中的放射性靶向治療效果,。本研究結(jié)果表明放射性標記的FAPI四聚體較單體FAPI-46在腫瘤攝取和滯留時間方面均有較大程度提升,。177Lu-DOTA-4P(FAPI)4在HT-1080-FAP及U87MG荷瘤裸鼠模型中顯示出了良好的抗腫瘤療效。這種多聚化研究策略有望為靶向FAP放射性探針的優(yōu)化策略提供新的研究方向,，為將來FAP放射靶向治療的發(fā)展提供了一種新的研究思路,。
