近日,，廈門大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科及福建省神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤診斷與精準治療王占祥教授團隊在國際知名學術(shù)期刊《Cell Death & Disease》（中科院一區(qū)TOP期刊，影響因子9.685）上發(fā)表了題為“The CDK inhibitor AT7519 inhibits human glioblastoma cell growth by inducing apoptosis, pyroptosis and cell cycle arrest”的原創(chuàng)性基礎(chǔ)研究論文,。廈門大學醫(yī)學院在讀碩士趙文鵬為該論文的第一作者,，廈門大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科王占祥教授和張炳長助理研究員為該論文的共同通訊作者,。
膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）是最致命的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤之一,。膠質(zhì)母細胞瘤患者的一線治療方案是以手術(shù)切除為主的綜合治療，包括術(shù)后放療聯(lián)合替莫唑胺（TMZ）輔助化療,。然而,，目前GBM患者的預(yù)后不佳，中位生存期仍不到15個月,。尋找治療GBM的新藥迫在眉睫,。
本論文采用高通量藥物篩選的方法，在臨床期小分子藥物庫中發(fā)現(xiàn)CDK抑制劑AT7519對GBM具有潛在的抗腫瘤活性,。AT7519是第二代多靶點周期蛋白依賴性激酶抑制劑,，可選擇性抑制CDK1、CDK2,、CDK4,、CDK6和CDK9。AT7519不但影響細胞周期的進程,，而且抑制RNA聚合酶II下游的轉(zhuǎn)錄,。AT7519在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中表現(xiàn)出良好的安全性和強大的抗腫瘤活性，目前處于臨床開發(fā)階段,。但是AT7519在膠質(zhì)母細胞瘤中的抗腫瘤機制目前還不清楚,。
用去除血清饑餓的方法將細胞周期同步化之后，U251和U87MG細胞單獨用培養(yǎng)基和0.4 mM的AT7519培養(yǎng)6,、12和24 h,，PI染色后流式儀分析細胞周期的具體比例,，結(jié)果顯示AT7519 處理U251和U87MG細胞6h后,，G1期和G2期細胞比例開始增加。當AT7519 處理U251和U87MG細胞24h時,，G1期細胞的比例顯著增加,。Western blot結(jié)果顯示與細胞周期G1-S轉(zhuǎn)化有關(guān)的p-RB,p-CDK2表達量顯著下降, 與細胞周期G2-M轉(zhuǎn)化有關(guān)的p-CDK1,cyclin B1![]()
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表達量顯著下降。綜上所述,，AT7519將U87MG和U251細胞阻滯在G1和G2期,。
U87MG, U251和GBM 原代細胞在AT7519處理后進行PI 和 Annexin-V -FITC 染色，流式細胞儀分析細胞凋亡情況。結(jié)果顯示在U87MG和U251細胞中,，AT7519以濃度依賴的方式顯著增加凋亡細胞的比例,。在GBM60 細胞中對照組和AT7519處理組的凋亡細胞比例是12.03% VS 77.93% (p < 0.0001，非配對t檢驗),，在GBM38 細胞中對照組和AT7519處理組的凋亡細胞比例是8.39% VS 69.73% (p < 0.0001,，非配對t檢驗)。Western blot結(jié)果顯示隨著AT7519濃度的升高,，抗凋亡蛋白MCL-1和BCL-2表達量在U87MG和U251 細胞中顯著下降,，促凋亡蛋白NOXA和線粒體釋放Cyt-c表達量顯著升高。這些內(nèi)源性凋亡信號分子的變化激活下游caspase-9, caspase-3 , and PARP1的活性, 出現(xiàn)cleaved caspase-9,，cleaved caspase-3,，cleaved PARP1這三種凋亡關(guān)鍵蛋白的表達增加。JC-1染色結(jié)果顯示,，AT7519可顯著降低U251和U87MG細胞的線粒體膜電位(p < 0.05,，非配對t檢驗)。我們進一步在GBM原代細胞中檢測凋亡關(guān)鍵蛋白表達情況,。Western blot結(jié)果顯示凋亡的標志性蛋白cleaved PARP1,、cleaved caspase-3在AT7519處理組中顯著增加。以上結(jié)果證明AT7519可以誘導(dǎo)GBM細胞凋亡,。
倒置顯微鏡下觀察AT7519處理48 h后的細胞形態(tài),，與對照組相比，在AT7519處理組中觀察到U251和U87MG細胞上有氣泡樣的突起,。掃描電鏡顯示AT7519處理后的U251和U87MG細胞膜上有多個小孔,。此外，在LDH釋放實驗中,，AT7519處理后的U87MG和U251細胞LDH釋放增多(p < 0.0001,，非配對t檢驗)，提示細胞膜的完整性受到了破壞,。Western blot檢測了gasdermin家族蛋白及其裂解蛋白,，結(jié)果顯示在U87MG和U251細胞中，隨著AT7519濃度的提高GSDME-N表達量逐漸升高,。進一步我們在GBM原代細胞進行了驗證,，Western blot結(jié)果顯示AT7519處理后焦亡的打孔蛋白GSDME-N表達增加。以上結(jié)果證明,，AT7519誘導(dǎo)gasdermin E裂解產(chǎn)生打孔蛋白,，進一步出現(xiàn)細胞腫脹、破裂,，導(dǎo)致GBM細胞焦亡,。接下來先用Z-VAD-FMK預(yù)處理,，然后用AT7519處理GBM細胞48 h。Western blot結(jié)果表明與單獨使用AT7519對比,，Z-VAD-FMK和AT7519聯(lián)合組中cleaved PARP1 and GSDME-N蛋白表達量顯著下降,。LDH釋放實驗結(jié)果顯示，與單獨使用AT7519對比,，Z-VAD-FMK與AT7519聯(lián)合處理后U87MG和U251細胞LDH釋放量顯著減少,。進一步Western blot結(jié)果顯示，caspase‐3特異性抑制劑（Z‐DEVD‐FMK）可以抑制GSDME-N的表達,。以上結(jié)果證明AT7519通過caspase-3裂解gasdermin E誘導(dǎo)GBM細胞焦亡,。
為了探究AT7519在體內(nèi)是否有抗腫瘤的作用。我們用U87MG細胞建立GBM皮下異種移植模型,，5天后以20mg/kg的劑量連續(xù)腹腔注射21天,。期間定期測量裸鼠的體重和腫瘤的體積。7天后,，AT7519治療組的皮下腫瘤體積開始減?。坏?/span>21天時AT7519治療組的皮下腫瘤重量和體積均明顯減小,，并且小鼠體重沒有明顯的變化,。在初步探究AT7519在體內(nèi)的安全性和抗腫瘤作用后，我們又在GBM顱內(nèi)異種移植裸鼠中驗證AT7519的抗腫瘤活性,。同樣以20mg/kg的AT7519連續(xù)腹腔注射AT7519 21天,，腦組織冠狀位切片后HE染色的結(jié)果顯示AT7519治療后顱內(nèi)腫瘤相對面積減少約一半(p < 0.05，非配對t檢驗),。Western blot檢測細胞焦亡,、凋亡和細胞周期相關(guān)關(guān)鍵蛋白，結(jié)果顯示AT7519處理組中cleaved caspase-3, cleaved PARP1和GSDME-N水平升高,，而p-CDK1和p-CDK2蛋白水平降低,。免疫組化的結(jié)果顯示，與對照組相比,，AT7519治療組腫瘤中的cleaved caspase-3和cleaved PARP1表達增加,，p-CDK1和p-CDK2表達明顯減少。以上結(jié)果證明AT7519在體內(nèi)通過誘導(dǎo)凋亡,、焦亡和細胞周期阻滯抑制膠質(zhì)母細胞瘤生長,。
綜上所述，AT7519在GBM細胞系,、原代細胞和異種移植裸鼠中通過阻滯細胞周期進程,、誘導(dǎo)細胞凋亡和焦亡的方式顯著抑制腫瘤的生長,。因此,，AT7519是一種治療GBM的潛在小分子靶向藥物,。
論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41419-022-05528-8
通訊作者
王占祥,，醫(yī)學博士，主任醫(yī)師,，教授,，博士生導(dǎo)師，中國醫(yī)療行業(yè)最高獎“中國醫(yī)師獎”獲得者,，國務(wù)院特殊津貼專家,。
從事臨床醫(yī)學研究與疾病救治工作近40年,，曾留學日本，多次到美國哈佛大學,，英國牛津大學等國際知名學術(shù)機構(gòu)進行交流訪問,，先后獲得福建省優(yōu)秀歸國人員，福建省突出貢獻中青年專家,，入選福建省新世紀百千萬人才工程。他是廈門市重點引進留學歸國人才,，廈門市杰出科技人才,，廈門市領(lǐng)軍人才，首屆廈門市醫(yī)學學術(shù)與技術(shù)帶頭人,，廈門市腦科中心學科帶頭人,，2022年被評為廈門經(jīng)濟特區(qū)建設(shè)40周年創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)人物,，廈門市科學技術(shù)重大貢獻獎獲得者。
現(xiàn)任廈門大學附屬第一醫(yī)院院長,，新冠肺炎定點救治醫(yī)院院長，國家神經(jīng)系統(tǒng)疾病醫(yī)學中心福建分中心主任,，福建省腦科疾病臨床醫(yī)學研究中心主任,，福建省神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤診斷與精準治療重點實驗室主任，廈門大學神經(jīng)科學系主任,。
王占祥是我國知名的神經(jīng)外科專家和學科帶頭人,，先后主持國家自然科學基金、國際交流課題,、新冠應(yīng)急攻關(guān)項目,，以及福建省和廈門市醫(yī)療衛(wèi)生重點項目等20余個項目,。在 STTT， JCI,， Nat Commun 等Top期刊發(fā)表論文 280 余篇（SCI 收錄 80 篇）,，參編參譯專著 12 部，參與臨床救治指南和專家共識12項,，獲批實用新型專利 8 項,，獲軍隊、省,、市級科技獎勵11項,。指導(dǎo)了福建省神經(jīng)外科專業(yè)第一位博士后，目前已指導(dǎo)博士后 7 位,，培養(yǎng)博,、碩士研究生 63 人。
第一作者
張炳長,，博士,，神經(jīng)外科助理研究員。作為項目負責人主持福建省自然科學基金項目1項,，參與4項科學基金,，包括自然科學基金項目1項，省市新冠應(yīng)急攻關(guān)項目各1項,。在《Signal Transduct Target Ther》,、《Sci China Life Sci》、《Cell Death and Disease》多個雜志發(fā)表SCI論文十余篇,。
第一作者
趙文鵬,，2020級廈門大學醫(yī)學院專業(yè)型外科學碩士研究生，師從全國知名神經(jīng)外科專家王占祥教授,，碩士期間主要從事膠質(zhì)瘤新藥的高通量篩選及抗腫瘤機制研究,。目前發(fā)表SCI論文9篇（其中第一作者2篇），相關(guān)研究成果受邀在中華醫(yī)學會神經(jīng)外科分會第十九次全國年會大會匯報,。2023年榮獲廈門大學“柳玉濱青年科技獎學金”,。
